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Cultivo in vitro de árboles frutales

Miss Chen
2017年08月26日
Multiplicación o reproducción de frutal in vitro



El cultivo in vitro es un método de propagación de plantas de aplicación profesional, puesto que se realiza en laboratorio, en unas condiciones estériles y con unas instalaciones especiales.

Un dato para dar una idea comercial es que en España había en 1.990 28 laboratorios dedicados a la producción de plantas por cultivo in vitro como negocio.

El cultivo in vitro consiste en tomar un trocito de hoja, un embrión, una porción pequeñita de tallo (de 0,2 a 1 milímetro) o cualquier otra parte de una planta y ponerla a cultivar en un tubo de ensayo sobre un medio acuoso nutritivo.

Lo fundamental es que se hace en unas condiciones muy controladas y totalmente estériles: utensilios, cámara de manipulación, etc., todo está desinfectado en autoclave.

El cultivo in vitro es muy caro, entre otras cosas porque no se puede mecanizar. Sólo son rentables aquellos laboratorios muy grandes y con mucho mercado. 

La planta ya desarrollada en el cultivo in vitro necesita una primera aclimatación en el laboratorio; en el invernadero y después una segunda aclimatación en el campo. Los viveros grandes realizan ambas operaciones; otros sólo se encargan del primer paso. 

Aplicaciones prácticas del cultivo in vitro:
Propagación vegetativa. Esto es lo más práctico. Dos técnicas:

- Micropropagación de estaquillas
- Organogénesis de callos

Producción de plantas libres de virus mediante dos técnicas:

- Cultivo de meristemos

- Microinjerto in vitro 

Permite hacer germinar semillas que son muy difícil de hacer en condiciones normales. Ejemplo: algunas Orquídeas tienen en los campos unos parásitos obligados y en viveros no se pueden reproducir; se inoculan esos parásitos o in vitro.

Eliminar la inhibición de germinación de las semillas. El cultivo in vitro es lo más eficaz porque tiene determinados inhibidores y algunos huesos de frutales no son capaces de germinar ya que no tiene desarrollado el embrión.

Prevención del aborto embrionario como resultado de incompatibilidad. Se da en cruces de interés científico o intergenéticos, sobre todo en plantas herbáceas. Los cruces incompatibles dan abortos.

Aplicación en mejora genética para obtener híbridos, para introducir material genético, etc.

Acortar los ciclos de mejora genética. No hay que esperar que pase el periodo juvenil del árbol para ver resultados.

Producción de haploides. Cruzamientos o cultivo de polen (anteras). Ventajas:

- Obtención rápida de homocigotos.

- Producción de híbridos (frutos puros).

Equipo necesario para el cultivo in vitro

- Autoclave
- Cámara de flujo laminar
- Medio de cultivo
- Planta
- Cámara de cultivo

- Autoclave

Es donde se "esteriliza" todo lo que vamos a utilizar: agua, algunos nutrientes, material, etc. No se pueden meter proteinas. Es como una olla a presión, pero de mayor tamaño, donde se controla la presión y la temperatura (hasta 120º).

- Cámara de flujo laminar

Es donde se realizan todas las manipulaciones con la planta. Es un habitáculo con un operario en un ambiente estéril. Se usan rayos ultravioletas para esterilizar el aire.

- Medio de cultivo

Agua y nutrientes (hormonas) en un tubo de ensayo, que se tapa con un tapón. Dependiendo del material que se va a propagar, el tubo se pone vertical o un poco inclinado.

- Planta

El material vegetal de partida puede ser del campo, pero esto conlleva un alto riesgo de enfermedades y contaminación, aunque se lave mucho y bien. Lo más corriente es utilizar brotes que crecen en condiciones controlada para que halla menos infecciones. 

- Cámara de cultivo

La cámara de cultivo es una habitación de dimensiones muy variables, en la que se controlan las condiciones de luz, temperatura, humedad, variación día-noche, etc..

Condiciones del cultivo in vitro
En la cámara de flujo laminar no puede entrar material contaminado. El problema más importante en todo el proceso del cultivo in vitro son las contaminaciones.

En el autoclave no se pueden meter determinadas sustancias, como vitaminas, antibióticos, ácido giberélico, sacarosa, encimas, extractos vegetales, etc., ni tampoco recipientes que no soporten altas temperaturas.

El vidrio ha de ser de muy buena calidad para que no suministre al medio sustancias contaminantes para la planta. Normalmente se prepara el medio y se filtra directamente. El problema es que se absorben en el filtro determinadas sustancias.

Los reguladores de crecimiento (hormonas) son imprescindibles, ya que sin ellos no se puede hacer el medio de cultivo.

El pH ideal es 6, pero puede oscilar entre 5,5 y 6,5.

Se necesita agar y medio sólido 0,6-0,9%.

El medio de cultivo realmente sólo tiene que llevar agua, fuente de energía (azúcares) y reguladores de crecimiento.

El medio de cultivo es secreto, y se pueden tardar dos años en prepararlo.

En la cámara de cultivo se aplican cantidades variables de luz (16-20 horas). También existen plantas que se desarrollan en la oscuridad. Las temperaturas también varían. Lo normal son 22-26ºC, aunque en ocasiones se exigen fríos de 4ºC y también 28-30ºC para plantas tropicales.

Igualmente, en el éxito de esta técnica de propagación también influyen determinadas características de la planta, como el tipo, genética e incluso el tipo de implante, parte más juvenil o más adulta.

En cuanto a los recipientes, deben permitir el intercambio de gases, pero evitar la pérdida de agua, lo que provocaría un aumento de la concentración de sales, y por tanto la muerte de la planta. De ahí la importancia del cierre. 
Subcultivos o replicado

Cuando sembramos microestaquillas en cultivo in vitro, no nos interesa que se emitan raíces ni hojas, sino que se produzca una proliferación (crecimiento) para obtener nuevas microestaquillas. Son lo que se denominan subcultivos. 

No se pueden hacer infinitamente ya que se agota el material vegetal; tan sólo se hace 8-10 veces. 

Ocurre entonces lo siguiente: 

- El medio nutritivo se agota y se seca.

- El material vegetal ocupa todo el tubo.

- Se produce un cambio de olor en el medio (sustancias tóxicas).

- El medio se hace líquido.

Fases del cultivo de meristemos

1. Toma un ápice meristemático (0,2-1 mm).

2. Siembra en el medio del tubo.

3. Fase de proliferación: crecimiento de brotes. Subcultivos.

4. Fase de enraizamiento (cambiar el medio).

5. Primera fase de aclimatación. Es muy importante el que la planta pueda llegar o no al campo. Invernaderos, bolsas de plástico, bandejas de vidrio, etc..

6. Segunda fase de aclimatación. Siempre en invernadero. 

7. Plantación en el campo.

Fases del cultivo de embriones

Se utiliza mucho en manzano.

1. Se desinfecta el fruto en alcohol. Se flamea.

2. Se coge el embrión de la semilla.

3. Se inocula en el tubo.

4. A las 1-2 semanas, la planta está más o menos reconocible.

5. Se deja crecer y se pasa por las fases de aclimatación.

Micropropagación

Se parte de una yema, de bráctea o axilar. 

Se empieza a desarrollar en el medio de cultivo.

Entre la fase de proliferación y de enraizamiento hay muchos subcultivos (para obtener más plantas).

El número de subcultivos depende del material vegetal. 

Ejemplo de micropropagación de Kiwi: 

- Se parte de un trozo de tallo.

- Al cabo de 4 semanas se obtiene una yema y crece un brote.

- En la fase de proliferación intentamos obtener gran cantidad de brotes.

- Sacamos microestaquillas del primer brote, haciendo subcultivos cada 6-8 semanas hasta llenar el vidrio.

- Al aumentar la concentración de auxinas se obtienen plantas enraizadas. 

- Puede hacerse de forma industrial y la fase de enraizamiento se hace en vivo.

Cultivo de callo in vitro

Se parte de un trozo de hoja o de tallo; bien de una planta madre de maceta o de una planta que viene de cultivo in vitro. 

El medio puede ser sólido o líquido. 

Se forma entonces una estructura de callo, de la que parten brotes, o también proembriones, que al unirse forman una estructura similar al embrión.

A partir de entonces se desarrolla normalmente.

Obtención de plantas haploides

Normalmente se trabaja con la antera en su totalidad, no con granos de polen en particular. 

De una yema de flor se coge una antera antes de que se abra y se hace un cultivo; bien por embriogénesis u organogénesis.
Embriogénesis: se forman células (poliembriones).

Organogénesis: se forma una estructura de callo que puede venir o bien de tejidos de la antera (diploide), o bien del grano de polen (haploide).
No se riega nunca por aspersión (riesgo de patógenos), siempre con regadera. 

Problemas en el cultivo in vitro

* Contaminación: es grave.

* Vitrificación: es una reacción de las plantas que las hace adquirir apariencia de vidrio. La única solución es hacer un subcultivo de material sano, es decir, se saca y se cortan los trocitos que estén bien. 
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